《生物技术大实验》课程教学大纲

一、编写说明

(一)本课程的性质、地位和作用

本课程由细胞工程，微生物工程，生物大分子分离与分析技术三部分组成。生物技术是一门多学科、综合性的科学技术,本课程的开设旨在使学生掌握一定的生物技术实验技能。

细胞工程实验课总学时为36学时，可集中一个星期集中完成。一些实验可以交叉进行，节省时间，多上实验，使学生掌握细胞工程的基本操作技能和方法。在学生掌握基本的实验原理和技术的基础上,给定实验目的,让学生自己设计实验方案,在教师的指导下完成实验。细胞工程大实验的内容可分为植物和动物两大部分。

《生物大分子分离与分析技术》是生物技术和生物科学专业必修课。本课程主要阐述如何从生物材料（动物、植物、微生物等）获取纯净、完整而有活力的生物大分子，以供对其结构与功能进行深入研究，从而揭示各种生命现象的本质。通过本课程的学习，使学生掌握如何从生物细胞分离纯化得到相关的生物大分子。不仅要使学生掌握一系列分离纯化技术而且要掌握纯度鉴定技术。主要介绍各专项技术的原理，同时也介绍操作要点及技巧，为学生从事分子水平的生命科学研究奠定良好基础。本课程设计思路是以蚯蚓为材料，提取、纯化纤溶酶，最终得到电泳纯级的纯品，并对其纯度、性质进行鉴定，展开各项实验，将各个实验组织为一个完整的技术体系；使同学们都感到他们正在进行一项科研课题，更能激发同学们的学习兴趣，使学生在掌握操作技能的同时，更培养他们的科研思路和创新意识。

微生物工程是生物技术的重要分支，其侧重于生物反应器过程和下游技术，其最终目的是建立工业生产过程为社会服务。而作为即将走上工作岗位的学生来说，学习，掌握一定的微生物工程方面得实验方法与技能是非常急需的。

（二）本大纲制定的依据

本大纲是根据生物技术和生物科学专业培养目标所需要的基本理论和基本技能的要求，根据本课程的教学性质、条件和教学实践而制定的。

（三）内容选编原则与要求

1、注意理论与实践结合，增加联系科研实际的内容。

2、关注生物大分子分离与分析技术发展前沿，将实验先进手段纳入教学内容。

3、通过对学生生物技术基本实验技能的训练，加强对学生动手能力的培养，同时力求理论联系实际地培养学生独立思考、综合分析能力、科学思维能力、创新意识，全面提高学生素质。

4、注重基本操作和基础性实验，并与分子生物学接轨，和其它学科交叉，增加了综合性实验的内容，

（四）教学时数分配表

（五）考核方法与要求

1．平时成绩：包括出勤、课堂提问、讨论情况等，占20％

2．操作成绩：实验的操作，及实验的效果等，占20％

3．报告成绩：实验报告等，占20％

4．考试成绩：占40％

5．综合考核成绩占100％

6．三门科单独考试，取平均分记录成绩

（六）教材与主要参考书

1．细胞工程大实验

教材：自编讲义

李志勇编著,《细胞工程》, 科学出版社,2008.8

参考书：周维燕主编，《植物细胞工程原理与技术》,中国农业大学出版，2001。

冯伯森主编，《动物细胞工程原理与实践》,科学出版社，2000。

王蒂主编，《细胞工程学》，中国农业出版社，2003.7.

周荣家，《转基因动物技术与应用》,程汉华主编，武汉大学出版社，1997

2．生物大分子分离与分析技术

教材：何忠效等，《现代生物技术概论》，北京师范大学出版社，北京，1999。

参考书：张树政等，《酶学研究技术》，科学出版社，北京，1987。

林卓坤，《色谱法》，科学出版社，北京，1984。

何忠效，张树政，《电泳》（第二版），科学出版社，北京，1999。

郭永，《现代生化技术》，华南理工大学出版社，广州，1996。

张龙翔等，生化实验方法和技术，科学教育出版社，北京，1997。

3．微生物工程

魏群，生物工程技术实验指导高等教育出版社 2002

贾士儒，生物工艺与工程实验技术中国轻工业出版社2002

二、教学内容纲要

Ⅰ细胞工程大实验

实验一植物组织和细胞培养实验（综合性设计大实验）

一实验目的

1．植物组织培养是60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整植株的过程。

2．掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，以及植物原生质体融合技术。

3．进行植物器官的离体培养（根、叶、花、胚珠等），掌握植物组织培养基本步骤。

二实验要求

1．根据细胞工程理论课所学知识，就以上实验目的设计出实验方案（包括所选用材料、实验技术、方法）。

2．实验方案须交指导教师修改，然后开始实验。

3．实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。

实验二动物细胞培养实验（综合性设计大实验）

一实验目的

1．使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程。

2．学习动物细胞原代培养和传代培养的基本方法，掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，以及培养细胞的形态分类特点。

3．以所培养细胞为材料，了解细胞冻存的几种简易方法并通过实验掌握其中的一种方法。

4．以所培养细胞为材料，学习动物细胞融合的几种方法并掌握其中的一种方法。

二实验要求

1．根据细胞工程理论课所学知识，就以上实验目的设计出实验方案（包括所选用材料、实验技术、方法）。

2．实验方案须交指导教师修改，然后开始实验。

3．实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。

三实验设备： CO₂培养箱，细胞融合仪，冷冻仪，研究用成像显微镜，体视成像显微镜，普通显微镜，生化培养箱，全自动高压灭菌锅，水浴锅，超声波清洗仪，超净工作台，真空泵，冷冻离心机，干燥箱，剪刀，镊子，液氮罐，纯水器，低温冰箱，普通冰箱等。

四实验耗材：各种规格培养瓶、离心管，吸水纸，各种试剂瓶，培养皿

五生化试剂：胰蛋白酶，胶元蛋白酶，M₉培养基，DMEM，RPMI1640培养基，M199培养基，牛尾胶元，肝素，秋水仙素，PHA，小牛血清，青霉素，链霉素，EDTA，HEPES，Hanks液，Earle液，荧光染料，快绿，谷氨酰胺，聚乙二醇，

六普通试剂：若干

七实验动物：小白鼠，兔子

Ⅱ生物大分子分离与分析技术（综合性实验）

实验三纤溶酶的抽提与沉淀技术

一、教学基本要求

通过本实验使学生掌握生物大分子的抽提与沉淀技术

二、教学内容

(一)纤溶酶粗品的抽提技术

要点：

原理

将生物大分子从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中，被制备物在该提取液中具有最大的溶解度和能保持天然活性。

步骤

1、采用机械法将蚯蚓进行破碎。

2、选择适宜的缓冲液提取粗酶液

(二)的沉淀技术

要点：利用盐析沉淀法得到纤溶酶粗品

原理：

蛋白质和酶在水溶液中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而减少，结果使蛋白质沉淀析出。在某一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度也不一样，借此可达到彼此分离的目的。

步骤

1、盐的选择

2、盐浓度的确定

3、盐析

4、沉淀蛋白的收集

作业：

实验四纤溶酶粗品的脱盐

一、教学基本要求

通过本实验使学生了解脱盐的方法和操作步骤。（两种方法任选一种）

二、教学内容

(一) 透析法

要点：将纤溶酶粗品（蛋白沉淀物）进行脱盐

原理：把蛋白质溶液装进半透膜制成的透析袋或透析槽中，在低温条件下，对蒸馏水或缓冲液进行透析。盐的相对分子质量小，可透过半透膜扩散到水或缓冲液中；蛋白质和酶相对分子质量大，不能透过半透膜而留在透析袋或透析槽中。通过水和缓冲液的不断更换，使蛋白质溶液中的盐分不断减少直至透析完全为止。

步骤：

1、对透析袋进行选择和处理。

2、将蛋白质沉淀装入透析袋中。

3、在水或缓冲液中进行透析。注意更换外液。

（二）凝胶层析法

要点：将纤溶酶粗品（蛋白沉淀物）进行脱盐

原理：凝胶内部具有很细微的多孔网状结构，当含盐的蛋白溶液经过胶柱时，大分子（蛋白质）不能进入凝胶内部而沿着凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子（盐）可以进入凝胶内部，流速缓慢，稍后流出柱外，从而将两者分开。

步骤：

1、选择并处理凝胶。

2、装住

3、点样

4、层析

5、收集样品、 处理样品

作业

实验五离子交换层析分离纤溶酶

一、教学基本要求：

1、通过本实验使学生掌握离子交换层析的原理

2、掌握离子交换层析分离大分子的技术和步骤。

二、教学内容

要点：将脱盐后的粗酶液经过离子交换层析柱后，进一步纯化

原理

根据离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而将混合物中不同物质分开。经过这一步可将带不同电荷量的组分分开。

步骤

1、离子交换剂选择和处理

2、装柱与平衡

3、样品的处理与上样

4、洗脱

5、样品的收集和处理

作业：

实验六　凝胶层析分离纤溶酶

一、教学基本要求

通过本实验使学生掌握凝胶层析的原理和技术步骤。

二、教学内容

要点：将离子交换层析分离到的活性部分再根据分子量的异同进一步纯化纤溶酶。

原理：凝胶内部具有很细微的多孔网状结构，当蛋白溶液经过胶柱时，分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部而沿着凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子蛋白质可以进入凝胶颗粒微孔，这样就使小分子物质向下移动的速度落后于大分子物质，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。

步骤：

6、选择并处理凝胶。

7、装住

8、点样

9、洗脱

10、收集样品、 处理样品

作业：

实验七聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离、鉴定纤溶酶

一、教学基本要求：

通过本实验使学生掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的原理和操作技能，对以上分离的样品的纯度进行鉴定和制备。

二、教学内容

原理

在某一PH条件下混合物中各个蛋白组分所带的电荷不同、净电荷的量也不同，在电场中的泳动方向和速度不同，从而将其分离开来。聚丙烯酰胺凝胶电泳兼具分子筛效应和电泳效应，具有较高的分辨率。

步骤

1、配制连续或不连续凝胶管或凝胶板

2、点样

3、电泳

4、染色及测活

5、鉴定和制备

作业：

实验八 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纤溶酶的分子量及亚基组成

一、教学基本要求：

通过本实验使学生掌握SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和操作技能，对以上分离的样品的分子量和亚基组成进行鉴定。

二、教学内容

原理：在蛋白质溶液中加入十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白质分子中的二硫键还原，SDS能使其氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成SDS---蛋白质复合物，在复合物内蛋白质分子只起个针垫的作用，而SDS分子像针似地插到蛋白质针垫上，指向外面的针头代表硫酸根基团的负电荷，针杆代表十二烷基。因此复合物上的电荷几乎完全被硫酸根负离子所覆盖，远远超过蛋白质的固有电荷。因此，所有蛋白质的泳动速率仅仅取决于蛋白质分子量的大小。在一定范围内其泳动速率与分子质量成直线关系。本法可以测定未知蛋白质的分子量，鉴定蛋白质的亚基组成及亚基的分子量。

步骤：

1、配制连续或不连续凝胶管或凝胶板

2、点样

3、电泳

4、染色

5、鉴定

作业：

1、计算纤溶酶的分子量

2、鉴定其亚基组成

实验九纤溶酶组分等电点的鉴定

一、教学基本要求

通过本实验使学生掌握等电聚焦(IEF) 电泳的原理和操作技能。对以上分离的样品的等电点进行鉴定。

二、教学内容

要点：

原理：

在电泳系统中加进两性电解质载体，当通以直流电时两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的PH梯度。当蛋白质或多肽进入这个体系时，不同的蛋白质即移到与其等电点相当的PH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。并测定出各蛋白质的等电点。

步骤：

1、制备PH梯度凝胶（PH=3—7）

2、准备电极缓冲液

3、加样

4、聚焦

5、样品组分的检测

作业

计算纤溶酶样品的等电点

Ⅲ微生物工程实验

实验十微生物菌体量与密度的测定

一、教学基本要求：

1.了解微生物菌体量与密度测量在微生物发酵中的重要性

2.了解测量微生物菌体量与密度测量的原理

3.掌握微生物菌体量与密度测量的方法

二、实验原理

采用光学方法进行菌体量的测定主要是比浊法。比浊法是指，当白色光通过光孔照射到菌体悬浮液时，会产生光的散射和光的透射现象。当利用浊度计测定菌体悬浮液浊度时通过测定样品的透射光率和散射光率，可确定菌体悬浮液的相对浓度。

进行液体或悬浮液的密度测定时，一般使用密度瓶，其操作简单。测量液体密度的密度瓶大小不同，形状各异，应以保证测量精度为目的，选择相应的密度瓶。当密度瓶装满溶液后，盖上盖，置于恒温槽中，此时通过毛细管可能会溢出部分溶液，应擦去，并将密度瓶外部仔细擦干净后称重。

密度瓶的容积为V，加入后称重为m_1，无水空瓶重为m₀

其中ρ_w所测温度下水的密度

三、教学内容：

1.测量微生物的菌体量

2.测量微生物的密度

实验十一亚硫酸盐法测定容积氧传递系数

一、教学基本要求：

1.明确亚硫酸盐法测定容积传递系数的原理

2.掌握亚硫酸盐法测定容积传递系数

3.掌握容积传递系数的计算方法

二、实验原理：

容积氧传递系数的测定有多种方法，亚硫酸盐法是应用较为广泛的一种。在正常条件下亚硫酸根离子的氧化反应非常快，远远大于氧的溶解速度。所以，氧一旦溶解于液相中立即被氧化，反应液中溶解氧浓度为零。此时氧的溶解速度最大。根据Na₂S₂O₃

三、教学内容：溶液消耗的体积量，可求Na₂SO₃的浓度。

1．硫酸盐法测定容积传递系数

2．计算容积传递系数

实验十二培养液粘度与混合特性的测定

一、教学基本要求：

1.了解培养液粘度测定的基本原理

2.掌握培养液粘度测定的方法

3.了解发酵罐搅拌功率的测定原理

4.掌握发酵罐搅拌功率的测定方法

二、教学内容：

1.测定培养掖的黏度

2.测定发酵罐的搅拌功率

实验十三黄酒的酿制(综合性实验)

一、教学基本要求：

1.学习黄酒酿制的基本原理

2.掌握黄酒酿制的基本工艺流程

二、实验原理

黄酒是中国古老的传统酒种，它的酿制过程实际是边糖化边发酵的双边发酵形式。淀粉质原料通过浸渍、蒸煮，使淀粉呈溶解糊化状态。经过糊化的淀粉容易被曲霉中的糖化酶作用，分解为可发酵性糖，既而在酵母菌的作用下，把可发酵性糖转化为酒精，并产生有机酸。同时通过蛋白质、脂肪等物质的分解，产生氨基酸、高级醇、脂类等物质。总之，黄酒是在多菌种共同作用下酿制而成的，从而给黄酒带来了丰富、复杂的成分，形成独特的风味特色。

三、教学内容:

1.纯种曲的制备

2.纯种曲的培养

3.纯种酒母的制备

4.原料的处理

5.糖化和发酵

6.后发酵

7.过滤

8.煎酒灭菌

四、实验材料：菌种糯米酒曲酒母

五、实验器材：高压蒸汽灭菌锅发酵缸玻璃三角漏斗布氏漏斗

六、教学时数： 9学时

实验十四液体发酵法生产链霉素(综合性实验)

一、目的要求

1.学习液体发酵的方法

2.学习链霉素的发酵方法及抗生素的检测和鉴定方法

二、实验原理

瓦克斯蔓于1943年分离到一株灰色链霉菌，能产生对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都有抗菌作用的新抗生素----链霉素。链霉素和其他抗生素一样是微生物的次生代谢产物。链霉素属于氨基糖苷类抗生素。

灰色链霉菌在下述条件下产生链霉素。对细胞足够供养；存在低浓度无机磷酸盐；足够的葡萄糖和足够高浓度的含氮物质。

在发酵培养基上，链霉素的发酵分3个阶段：生长阶段，菌丝形成，需氧量极大，在两天内形成链霉素不多；成熟阶段，菌丝及重量保持稳定，葡萄糖及其他碳源在培养基中消失，形成链霉素；老化阶段，有许多链霉素形成，然后链霉素产生停止，浓度下降，pH上升，菌丝自溶，需氧量减少，此时停止发酵。

在中性溶液中，链霉素成为3价阳离子故可用阳离子交换树脂吸附，然后进行洗脱和收集。二次洗脱液要通过高交联度的氢型树脂，以除去阳离子、无机杂质和小分子有机杂质。精制液用硫酸或氢氧化钡调至PH4.5~5.0,再加入适量活性炭,常温下脱色,可得到链霉素精制液。

三、教学内容:

1.斜面孢子制备

2.母瓶培养液的制备

3.种子培养液的制备

4.发酵培养

5.发酵液的预处理

6.发酵液抑菌实验

7.链霉素的纸层析鉴定

四、仪器

恒温培养箱

振荡器

离心机

五、材料

菌种麸皮米糠红薯玉米面马铃薯蔗糖硝酸钾磷酸二氢钾硫酸镁氯化钾硫酸亚铁碳酸钙硫酸正丙醇浓氨水活性炭阳离子树脂三角瓶灭菌的搪瓷缸新华三号滤纸毛细管分液漏斗层析缸

六、试剂

查氏培养基一级种子培养基二级种子培养基发酵培养基 0.1%酚酞试剂 0.04%溴甲酚绿乙醇0.142mol/L氢氧化钠2％标准柠檬酸溶液展层溶剂

实验十五固体发酵法生产柠檬酸 (综合性实验)

一、目的要求

1.学习固体发酵的方法

2.了解柠檬酸发酵的原理

3.学习柠檬酸发酵的过程

4.掌握柠檬酸提取的方法

二、实验原理

能后产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。目前主用黑曲霉通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。发酵发生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物生产糖化酶首先将淀粉转化为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径转变为丙酮酸，丙酮酸经过丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和二氧化碳，既而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成柠檬酸。产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。本实验以马铃薯为原料利用黑曲霉经固体发酵生产柠檬酸。

三、教学内容

1.种子制备

2.发酵培养

3.柠檬酸提取

4.酸解及后续处理

5.总酸量测定

6.纸层析法鉴定柠檬酸

四、仪器

5L发酵罐恒温摇床冷冻离心机高压灭菌锅

五、材料

灰色链霉菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌葡萄糖蛋白胨豌豆正丁醇三角瓶新华三号滤纸层析缸陶瓷盘毛细管培养皿

六、试剂

牛肉膏蛋白胨培养基豌豆培养基查氏培养基链霉素标准溶液展层溶剂系统